ETEC 987P基因工程乳酸菌的制备及其免疫效果的检测

【摘要】产肠毒属性大肠杆菌（EnterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC）是人和多种动物感染腹泻的重要病原菌之一，引起新生仔猪腹泻和死亡的几率非常高。黏附素和肠毒素是ETEC致病过程中的主要致病因子，他们在致病过程中缺一不可。其中黏附素结合到宿主易感染的上皮细胞是ETEC感染的第一步，也是最重要的关键步骤。目前引起仔猪腹泻的菌毛抗原主要有K88、K99、987P、F41等类型。本试验选择987P菌毛抗原，并将扩增出的987P基因片段克隆到大肠杆菌与干酪乳杆菌穿梭质粒载体中，从而构建了pLA-987P重组质粒，在将重组质粒电转化到干酪乳杆菌中，得到了重组干酪乳杆菌pLA-987P/L.casei，通过SDS-PAGE、Westernblot、间接免疫荧光及流式细胞术等来检测重组蛋白的表达情况，结果表明，融合蛋白成功的展示在了干酪乳杆菌表面，我们将获得的重组干酪乳杆菌命名为pLA-987P/L.casei。将鉴定正确的重组干酪乳杆菌pLA-987P/L.casei口服接种SPF级BABL/c小鼠，同时将获得的重组菌同pLA-K99-K88-LTB/L.casei混合后一同免疫小鼠，免疫后于不同时间点采集小鼠的血液样本，用来测定小鼠血清中抗987P的特异性IgG水平和IgG亚类水平；收集小鼠的粪便样品、肠道冲洗液和气管冲洗液用来检测抗987P的特异性sIgA水平；并通过MTT法检测T淋巴细胞的特异性增殖转化能力，并且运用ELISPOT进行细胞因子的分析；然后对小鼠进行攻毒保护性试验。结果表明重组干酪乳杆菌pLA-987P/L.casei免疫小鼠后能够在小鼠血清内检测到明显的抗987P特异性IgG抗体水平，对IgG亚类的分析表明产生的抗体主要是IgG1，其次是IgG2a和IgG2b；在粪便样本和小肠、气管冲洗液中检测到了明显的抗987P特异性sIgA抗体；淋巴细胞增殖试验测定结果显示，免疫组可以产生明显的细胞免疫应答；ELISPOT结果显示免疫类型偏向Th2型免疫。攻毒保护性试验结果显示免疫组小鼠的保护率均在75%以上，而对照组全部死亡，说明该重组菌对小鼠有保护作用，ETEC987P基因工程乳酸菌可以作为防治ETEC感染的候选口服疫苗。ELISA结果还显示，单独免疫重组菌pLA-987P/L.casei后获得的抗体水平要比免疫pLA-987P/L.casei和pLA-K99-K88-LTB/L.casei混合菌后获得的抗体水平低，说明混合后免疫达到的效果更为理想。
【作者】齐浩；
【导师】余丽芸；
【作者基本信息】黑龙江八一农垦大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】产肠毒属性大肠杆菌；987P菌毛蛋白；干酪乳杆菌；黏膜免疫；

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